【產(chǎn)品編號(hào)】2793951

【英文名稱】5fC CLEVER-seq Kit

【中文名稱】全基因組5-醛基胞嘧啶單細(xì)胞檢測(cè)試劑盒

【產(chǎn)品內(nèi)容】

注：溶液P1：丙二腈反應(yīng)液；M：丙二腈

【保存條件】模式序列置于-20 °C，可保存12個(gè)月。

  M和溶液P1置于4 °C，可保存12個(gè)月。

M需避光保存。

【產(chǎn)品概述】

5-甲基胞嘧啶修飾（5mC）是真核細(xì)胞基因組中最為重要的表觀遺傳修飾之一。5mC可以在TET家族酶的作用下逐步氧化生成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）；對(duì)于上述幾種新型DNA修飾的功能研究是目前核酸表觀遺傳學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

百靈威推出新型單細(xì)胞5fC檢測(cè)試劑盒，它主要用于單細(xì)胞5-醛基胞嘧啶 (5-formylcytosine, 5fC）的全基因組單堿基分辨率測(cè)序；也可應(yīng)用于5fC在早期胚胎發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程的生物學(xué)功能研究。

【自備材料】

• Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)

• NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，＃E7645）

• NEBNext Singleplex or Multiplex Oligos for Illumina (NEB #E7350, #E7335, #E7500, #E7600, #E6609, #E7710, or #E7730)

• MALBAC Single Cell WGA Kit（Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）

• AMPure XP Beads（Beckman Coulter, Inc. #A63881）

• 無水乙醇

• 滅菌超純水

• 低吸附EP、PCR管

• 磁力架

• PCR熱循環(huán)儀

• Thermo-mixer (Eppendorf)

【流程概述】

5fC CLEVER-seq Kit 原理圖

【注意事項(xiàng)】

A.    磁珠操作注意事項(xiàng)：

• 應(yīng)將磁珠孵育至室溫后再使用

• 每次吸取磁珠前都應(yīng)將其充分混勻

• DNA樣品加入磁珠后應(yīng)將其充分混勻

• 所有磁珠操作都應(yīng)于室溫進(jìn)行

• 移取上清操作應(yīng)在磁珠被徹底吸附后小心進(jìn)行

• 磁珠在洗脫之前應(yīng)充分干燥,避免乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)實(shí)驗(yàn)

B.    避免樣品交叉污染

• 吸取不同樣品時(shí)更換槍頭

C.  酶的取放應(yīng)在冰上進(jìn)行，為避免反復(fù)凍融或長(zhǎng)期使用后活性下降,我們推薦您在首次使用后將剩余試劑小份分裝凍存。

D. 單細(xì)胞避免污染

•單細(xì)胞操作微量DNA，在預(yù)擴(kuò)增前，操作需在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，避免污染

•溶液吸取需使用帶濾芯的槍頭

E. 預(yù)擴(kuò)增前所有反應(yīng)需在一個(gè)EP管中進(jìn)行

【實(shí)驗(yàn)步驟】

起始材料：將分選好的一個(gè)單細(xì)胞置于MALBAC Single Cell WGA Kit （Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）的Cell Lysis Buffer中。

一. 細(xì)胞裂解

按照MALBAC Single Cell WGA Kit（Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）說明書進(jìn)行細(xì)胞裂解。

二. M介導(dǎo)的5fC標(biāo)記

在裂解的細(xì)胞中加入1ul M， 1ul溶液P1和1ul模式序列，充分混勻，置于Thermo-mixer (Eppendorf)中，37°C，850rmp避光反應(yīng)20h。

三. 單細(xì)胞擴(kuò)增

1. 將標(biāo)記完成的細(xì)胞按照MALBAC Single Cell WGA Kit（Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）說明書進(jìn)行單細(xì)胞擴(kuò)增。

2. 擴(kuò)增完成后，按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)說明書純化上述完成擴(kuò)增的單細(xì)胞。

注：加入30ul 洗脫緩沖液洗脫。

四．文庫構(gòu)建

按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，＃E7645)說明書進(jìn)行建庫擴(kuò)增。