【產(chǎn)品編號】2793949

【英文名稱】5fC fC-CET Kit

【中文名稱】全基因組5-醛基胞嘧啶檢測試劑盒

【產(chǎn)品內(nèi)容】

注：溶液P1：疊氮茚二酮反應(yīng)液；AI：疊氮茚二酮

【保存條件】AI溶液、DBCO、模式序列、5fC模式序列引物和Control模式序列引物置于

-20 °C，可保存12個月。

溶液P1、Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1、溶液BD、溶液BW和溶液TW置于4 °C，可保存12個月。

【產(chǎn)品概述】

5-甲基胞嘧啶修飾（5mC）是真核細(xì)胞基因組中最為重要的表觀遺傳修飾之一。5mC可以在TET家族酶的作用下逐步氧化生成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）；對于上述幾種新型DNA修飾的功能研究是目前核酸表觀遺傳學(xué)的一個研究熱點。

百靈威推出新型5fC檢測試劑盒，它主要用于5-醛基胞嘧啶（5-formylcytosine, 5fC）的全基因組單堿基分辨率測序；也可應(yīng)用于5fC在生物發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展過程的生物學(xué)功能研究。

【流程概述】

5fC fC-CET Kit 原理圖

 【自備材料】

•Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)

• NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，＃E7645)

• NEBNext Singleplex or Multiplex Oligos for Illumina (NEB #E7350, #E7335, #E7500, #E7600, #E6609, #E7710, or #E7730)

• NEBNext® End Repair Module (NEB ＃E6050)

• AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881)

• SYBR Premix Ex TaqTM II (Takara, Cat. # RR82LR)

• MightyAmp® DNA Polymerase Ver.3 (TaKaRa, Cat.#R076A)

• Bio-Spin® P-30 Gel Columns, Tris Buffer (BioRad#7326231)

• 二硫蘇糖醇DTT(0.05mM)

• 無水乙醇

• 滅菌超純水

• 低吸附EP、PCR管

• 磁力架

• PCR熱循環(huán)儀

• 旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer)

• Thermo-mixer (Eppendorf)

【注意事項】

A.    磁珠操作注意事項：

• 應(yīng)將磁珠孵育至室溫后再使用

• 每次吸取磁珠前都應(yīng)將其充分混勻

• DNA樣品加入磁珠后應(yīng)將其充分混勻

• 所有磁珠操作都應(yīng)于室溫進(jìn)行

• 移取上清操作應(yīng)在磁珠被徹底吸附后小心進(jìn)行

• 磁珠在洗脫之前應(yīng)充分干燥,避免乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)實驗

B.    避免樣品交叉污染

• 吸取不同樣品時更換槍頭

C. 請嚴(yán)格按照實驗步驟進(jìn)行，修改實驗步驟會對富集造成影響

D. 酶的取放應(yīng)在冰上進(jìn)行，為避免反復(fù)凍融或長期使用后活性下降,我們推薦您在首次使用后將剩余試劑小份分裝凍存。

【實驗步驟】

一. 末端修復(fù)

1. 將片段化的DNA（平均長度約300bp），按照NEBNext® End Repair Module(NEB ＃E6050)說明書進(jìn)行末端修復(fù)。

2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化DNA。

3. 加入52 ul 超純水，洗脫，吸取50 ul至新EP管中，準(zhǔn)備下一步反應(yīng)。

注：純化后DNA純度要求：OD 260／OD 280= 1.8～2.0

二. AI介導(dǎo)的5fC標(biāo)記

1. 向上述50 ul洗脫液中加入50 ul溶液P1，充分混勻。

2. 全部轉(zhuǎn)移至裝有AI溶液的EP管中，充分混勻，置于Thermo-mixer (Eppendorf)中，37°C，850rmp反應(yīng)24h。

3. 24h后，將EP管取出，12,000 rpm (~13,400×g) 離心2 min。

4. 將上清取出，轉(zhuǎn)移至新EP管中。

注意：取上清時，若吸到沉淀，需重復(fù)步驟3。

5. 按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060) 說明書純化上清。

三. 文庫構(gòu)建

1. 按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina說明書，將上述純化后的上清進(jìn)行NEBNext End Prep. 和Adaptor Ligation操作。

2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化上述產(chǎn)物，加入51 ul 超純水洗脫，吸取49 ul至新EP管中，準(zhǔn)備下一步反應(yīng)。

四．化學(xué)反應(yīng)

1. 向上述49 ul洗脫液中加入1ul DBCO（20mM），置于Thermo-mixer (Eppendorf)中，37°C，850rmp反應(yīng)1h。

2. 1h后，按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)說明書純化上述溶液。

注：用25μl洗脫緩沖液洗脫。

五．富集含有5fC的片段

1. Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1（以下簡稱C1 beads）處理：

1）將Dynabeads™ MyOne™ Streptavidin C1（以下簡稱C1 beads）充分混勻, 吸取10ul至新EP管中。

2）置于磁力架上，放置2.5 min，待溶液完全澄清后，棄去上清。

3）加入1 mL溶液BW，將C1 beads完全重懸，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)混勻1 min。

4）取下后短暫離心，置于磁力架上，放置2.5 min，待溶液完全澄清后，棄去上清。

5）重復(fù)步驟3，4兩次。

6）加入20ul溶液BD，重懸C1 beads待用。

2. 取20ul第四步純化后的DNA至新EP管中，加入20ul上述待用C1 beads，充分混勻，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)孵育30min。

3. 取下后100g 離心10s，置于磁力架上，放置2.5 min，待溶液完全澄清后，棄去上清。

4. 加入1 mL溶液BW，重懸C1 beads（注：動作盡可能輕揉），置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)混勻3 min。

5. 取下后100g 離心10s，置于磁力架上，放置2.5 min，待溶液完全澄清后，棄去上清。

6. 重復(fù)步驟4,5三次。

7. 加入1 mL溶液TW，重懸C1 beads（注：動作盡可能輕揉），置于旋轉(zhuǎn)混勻儀(Rotating Mixer) 旋轉(zhuǎn)混勻2min。

8. 取下后100g 離心10s，置于磁力架上，放置2.5 min，待溶液完全澄清后，棄去上清。

9. 重復(fù)步驟7，8一次。

10. 加入10ul新配的0.05mM 二硫蘇糖醇DTT溶液，重懸C1 beads（注：動作盡可能輕揉），置于Thermo-mixer (Eppendorf)中，37°C，750rmp反應(yīng)1h。

注：0.05mM 二硫蘇糖醇DTT溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用

每20min取出再混勻一次，防止C1 beads沉底

11. 1h后，置于磁力架上，放置2min，待溶液完全澄清后，取上清至新EP管中，加20ul超純水稀釋。

12. 按照Bio-Spin® P-30 Gel Columns說明書純化上述溶液。

六．PCR富集

1. 按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，＃E7645)說明書進(jìn)行PCR 反應(yīng)。

2. 按照AMPure XP Beads(Beckman Coulter, Inc. #A63881)說明書純化上述PCR產(chǎn)物，加入23 ul 超純水，洗脫至新EP管中，于-20°C保存。

【延伸拓展】

5-羥甲基胞嘧啶作為基因組上另一種含量更高、更重要的核酸修飾，可以被氧化劑釕酸鉀特異性氧化成5-醛基胞嘧啶，而基因組上原有的5-醛基胞嘧啶可以被乙基羥胺特異性保護(hù)。將本試劑盒與5-羥甲基胞嘧啶的氧化和5-醛基胞嘧啶的保護(hù)結(jié)合起來，可以實現(xiàn)5-羥甲基胞嘧啶的全基因組單堿基分辨率檢測。釕酸鉀可通過購買高釕酸鉀(Aldrich, 334537)制備，乙基羥胺可直接購買(Aldrich, 274992)。具體操作可參照以下參考文獻(xiàn)：

Hu Z. et al. Bisulfite-Free, Nanoscale Analysis of 5‐Hydroxymethylcytosine at Single Base Resolution J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 13