【產(chǎn)品編號(hào)】2749381

【英文名稱】SPE-Ti-IMAC, 100%

【中文名稱】固相萃取固定化親和色譜微球

【產(chǎn)品內(nèi)容】250mg, 2g

【產(chǎn)品內(nèi)容】室溫儲(chǔ)存，保存期為五年。
【產(chǎn)品概述】本產(chǎn)品適用于對(duì)磷酸肽的鑒定和富集。

【自備材料】

•樣品：蛋白酶解液

注意：蛋白酶解液中不能含有干擾磷酸肽富集的物質(zhì)，如EDTA等絡(luò)合劑、含磷酸根的緩沖鹽！

•Loading buffer：80%ACN/6%TFA水溶液

作用：將酶解液酸化，高濃度的TFA-可以抑制酸性肽段的殘留

•Wash buffer 1: 50%ACN/6%TFA/200 mM NaCl水溶液

作用：洗滌非特異性吸附的肽段，鹽可以抑制非磷酸肽的殘留。

•Wash buffer 2：30%ACN/0.1%TFA水溶液

作用：洗滌殘留的Wash buffer1中的鹽。

•Elution buffer：10%氨水溶液

•耗材：200 μL槍頭、600 ul離心管、1.5 ml離心管、直徑為1 mm的篩板

•Tip柱準(zhǔn)備：

1)      將1 mm的篩板填入200 μL槍頭中，如圖1a-b所示，盡可能填的靠近槍頭的底端。

圖1

2)      如圖2所示，將600 μL離心管剪開(kāi)，在離心管蓋中間打孔，使200 μL槍頭可以卡在圖1c所示位置；

圖2

3)      如圖1d所示，1 mL離心管剪掉蓋子作為套管，然后在200 μL的槍頭中加入適量已螯合Ti⁴⁺的SPE-Ti-IMAC材料，Tip柱制作完成，如圖3所示。

圖3

【注意事項(xiàng)】

本產(chǎn)品SPE-Ti-IMAC材料未螯合Ti⁴⁺，首先應(yīng)先將Ti⁴⁺螯合到材料上，然后再進(jìn)行磷酸肽富集。

200 ul槍頭一般建議最多裝10 mg SPE-Ti-IMAC材料，如果樣品起始量較大，請(qǐng)按比例增加SPE-Ti-IMAC材料使用量。當(dāng)材料使用量為100 mg以下，可以使用柱管體積為1 ml的SPE柱管及其對(duì)應(yīng)篩板；當(dāng)材料用量為100-200 mg時(shí)，可使用柱管體積為3 ml左右的SPE柱管及其對(duì)應(yīng)篩板。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

一、  SPE-Ti-IMAC材料的Ti⁴⁺螯合

1.      按照SPE-Ti-IMAC材料:硫酸鈦Ti(SO4)2 = 1:50 (m/m)，稱取材料和硫酸鈦。以稱取500 mg材料為例，將25 g硫酸鈦固體加入50 mL平底離心管中，加入純凈水至40 ml，超聲溶解 (注意：硫酸鈦在溶解過(guò)程中會(huì)放熱，請(qǐng)緩慢加入)。向硫酸鈦溶液中加入SPE-Ti-IMAC材料，混勻，置于Rolling Incubator上搖勻，室溫過(guò)夜，請(qǐng)勿磁力攪拌。

注意：可按照實(shí)際制備情況酌情稱取材料和硫酸鈦，建議SPE-Ti-IMAC材料不要低于500 mg。

2.      次日，將步驟1中的SPE-Ti-IMAC材料靜置至其完全沉到離心管底部，棄上清。

3.      加入適量0.1% TFA水溶液將SPE-Ti-IMAC材料分散，混勻，靜置至其完全沉到離心管底部，棄上清。

4.      重復(fù)步驟3，洗5-6次左右，目的是盡量去除未螯合的Ti⁴⁺。

5.      加入200 mM NaCl/0.1% TFA水溶液洗滌SPE-Ti-IMAC材料2次。

6.      加入0.1% TFA水溶液洗滌2次，均勻轉(zhuǎn)移至離心管中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將SPE-Ti-IMAC材料分散成不同的濃度（如100 mg/ml或10 mg/ml），于4℃保存。

7.      檢測(cè)SPE-Ti-IMAC材料是否成功螯合Ti⁴⁺：取100 uL最后一次洗滌的上清液，加入100 uL 30% H2O2（市售雙氧水原液）中，若溶液不變色，說(shuō)明螯合后的SPE-Ti-IMAC材料已經(jīng)洗干凈。若溶液變色，則繼續(xù)洗滌。同時(shí)，可取少量SPE-Ti-IMAC材料，加入100 uL 30% H2O2中，若材料呈現(xiàn)明顯黃色，說(shuō)明Ti⁴⁺螯合的SPE-Ti-IMAC材料制備成功，可用于后續(xù)磷酸肽富集。

注意：上述3-6步驟為SPE-Ti-IMAC材料的洗滌，主要目的是洗滌未螯合的Ti⁴⁺，請(qǐng)勿省略。

二.     Tip (SPE)法富集磷酸化肽

1.      蛋白酶解液與Loading buffer按體積比1:1均勻混合，SPE-Ti-IMAC：蛋白酶解液= 20:1-30:1（m/m）均勻混合。以下以250 ug蛋白酶解液，SPE-Ti-IMAC材料：蛋白酶解液=20:1為例。

注意：Loading buffer一定要足量，保證TFA終濃度≥3%；因SPE-Ti-IMAC材料在Ti⁴⁺螯合過(guò)程中會(huì)略有損失，建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況，自行優(yōu)化材料與樣品的使用比例，以達(dá)到最優(yōu)使用效果！

2.      向5 mgTi⁴⁺螯合的SPE-Ti-IMAC Tip柱中加入200 μL 0.1%TFA，清洗材料。

3.      250 μL蛋白酶解液（1 μg/μL）與Loading buffer按體積比1:1充分混合，加入到Tip柱中進(jìn)行富集，總時(shí)間控制在20 min左右。

4.      加入200 μL Wash buffer 1洗滌，除去非特異性吸附，重復(fù)1次，總時(shí)間控制在10 min左右。

5.      加入200 μL Wash buffer 2洗滌1次，除去上述步驟中殘留的鹽，時(shí)間控制在5 min左右。

6.      加入200 μL Elution buffer洗脫2次，合并洗脫液，即富集好的磷酸肽，總時(shí)間控制在15 min左右。

7.      洗脫的樣品在凍干機(jī)中凍干，于-20℃保存，質(zhì)譜分析時(shí)需用1% FA復(fù)溶。

注意：Tip法富集磷酸化肽一般通過(guò)離心的方式進(jìn)行，一是為了更好的控制液體從Tip中的流出速度（以上述5 mgSPE-Ti-IMAC Tip柱為例，上樣和洗脫的過(guò)程離心力一般控制在80-100 g，洗滌過(guò)程控制在200 g），二是可以保證條件的一致，從而保證結(jié)果的重現(xiàn)性。上述2-5步驟中的時(shí)間為離心時(shí)間。