【產(chǎn)品編號(hào)】2749380
【英文名稱】CAE-Ti-IMAC, 100%
【中文名稱】單分散固定化親和色譜微球
【產(chǎn)品內(nèi)容】250mg, 1g
【保存條件】室溫儲(chǔ)存,保質(zhì)期為五年。
【產(chǎn)品概述】本產(chǎn)品適用于對磷酸肽的鑒定和富集。
【自備材料】
•樣品:蛋白酶解液
注意:蛋白酶解液中不能含有干擾磷酸肽富集的物質(zhì),如EDTA等絡(luò)合劑、含磷酸根的緩沖鹽!
•Loading buffer:80%ACN/6%TFA水溶液
作用:將酶解液酸化,高濃度的TFA-可以抑制酸性肽段的殘留
•Wash buffer 1:50%ACN/6%TFA/200 mM NaCl水溶液
作用:洗滌非特異性吸附的肽段,鹽可以抑制非磷酸肽的殘留。
•Wash buffer 2:30%ACN/0.1%TFA水溶液
作用:洗滌殘留的Wash buffer1中的鹽。
•Elution buffer:10%氨水溶液
【注意事項(xiàng)】
本產(chǎn)品CAE-Ti-IMAC材料未螯合Ti4+,首先應(yīng)先將Ti4+螯合到材料上,然后再進(jìn)行磷酸肽富集。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
一. CAE-Ti-IMAC材料的Ti4+螯合
1. 按照CAE-Ti-IMAC材料:硫酸鈦Ti(SO4)2 = 1:100 (m/m),稱取材料和硫酸鈦。以稱取300mg材料為例,將30g硫酸鈦固體加入250 mL燒瓶中,加入150 mL純凈水超聲溶解(注意:硫酸鈦在溶解過程中會(huì)放熱,請緩慢加入),超聲分散5-10 min,然后磁力攪拌(磁力攪拌的速度需要控制,將材料勻漿均勻?yàn)橐,不宜過快或過慢),室溫放置12h。
注意: 可按照實(shí)際制備情況酌情稱取材料和硫酸鈦,建議CAE-Ti-IMAC材料不低于250mg。
2. 將步驟1中的材料轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,15000 g離心3-5 min,棄上清。
3. 加入適量0.1% TFA水溶液將CAE-Ti-IMAC材料分散,轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,振蕩洗滌未鍵合的Ti4+,15000 g離心3-5 min,棄上清。
4. 重復(fù)步驟3,洗滌5-6次,目的是盡量去除未螯合的Ti4+。
5. 加入200 mM NaCl/0.1% TFA水溶液,洗滌CAE-Ti-IMAC材料2次。
6. 加入0.1% TFA水溶液,洗滌2次,均勻轉(zhuǎn)移至離心管中,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將CAE-Ti-IMAC材料分散成不同的濃度(如100 mg/ml或10 mg/ml),于4℃保存。
7. 檢測CAE-Ti-IMAC材料是否成功螯合Ti4+:取100 uL最后一次洗滌的上清液,加入100 uL 30% H2O2(市售雙氧水原液)中,若溶液不變色,說明螯合后的CAE-Ti-IMAC材料已經(jīng)洗干凈。若溶液變色,則繼續(xù)洗滌。同時(shí),可取少量CAE-Ti-IMAC材料,加入100 uL 30% H2O2中,若材料呈現(xiàn)明顯黃色,說明Ti4+螯合的CAE-Ti-IMAC材料制備成功,可用于后續(xù)磷酸肽富集。
注意:上述3-6步為CAE-Ti-IMAC材料的洗滌,主要目的是洗滌未螯合的Ti4+,請勿省略;因所用離心機(jī)不同,離心力可根據(jù)離心效果適當(dāng)調(diào)整,保證離心后CAE-Ti-IMAC材料無懸浮,上清液澄清。
二. 溶液法富集磷酸化肽
1. 蛋白酶解液與Loading buffer按體積比1:1均勻混合,已螯合Ti4+的CAE-Ti-IMAC材料:蛋白酶解液= 20:1-30:1(m/m)均勻混合,置于振蕩器上室溫振蕩30 min,然后15000 g離心3-5 min,棄上清。
注意:Loading buffer用量一定要足夠,保證TFA終濃度≥3%;因CAE-Ti-IMAC材料在Ti4+螯合過程中會(huì)略有所損失,建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況,自行優(yōu)化材料與樣品的使用比例,以達(dá)到最優(yōu)使用效果!
2. 加入適量Wash buffer 1,重懸材料,振蕩30min,15000 g離心3-5 min,棄上清。
3. 加入適量Wash buffer 2,重懸材料,振蕩30min,15000 g離心3-5 min,棄上清。
注意:步驟3可重復(fù)操作,目的是徹底清除NaCl,因?yàn)殁c鹽禁止進(jìn)質(zhì)譜!
4. 加入適量的Elution buffer,冰浴超聲5 min,振蕩15 min,20000 g離心3-5 min,收集上清液(注意:盡量不要吸到沉淀的材料)。
注意:建議重復(fù)步驟4,合并兩次洗脫液。
5. 將合并洗脫液25000 g離心3-5 min,轉(zhuǎn)移上清至新離心管中。離心濃縮干燥后,-20℃保存,待質(zhì)譜分析。
注意:步驟5很重要,保證洗脫液中材料去除完全,以免后續(xù)分析時(shí)材料堵塞色譜柱!
6. 將凍干后的樣品復(fù)溶在一定體積的1%FA水溶液中,質(zhì)譜分析。
注意:富集后的磷酸肽也可以用ZipTip 或 StageTip進(jìn)行除鹽后再質(zhì)譜分析。